Eine nichtkompetitive Hemmung, auch als antikompetitive Hemmung bekannt, liegt vor, wenn ein Enzymhemmer nur an den zwischen Enzym und Substrat gebildeten Komplex (ES-Komplex) bindet. Eine nichtkompetitive Hemmung tritt typischerweise bei Reaktionen mit zwei oder mehr Substraten oder Produkten auf. Die nichtkompetitive Hemmung unterscheidet sich von der kompetitiven Hemmung durch zwei Beobachtungen: erstens kann die nichtkompetitive Hemmung nicht durch Erhöhen von [S] rückgängig gemacht werden und zweitens liefert der Lineweaver-Burk-Plot parallele anstatt sich schneidende Linien.